Ένα ανθρώπινο 3D μοντέλο για τη μελέτη του Συνδρόμου Kleefstra

Πώς μπορούμε να μελετήσουμε στο εργαστήριο τι συμβαίνει στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο όταν το EHMT1 δεν λειτουργεί φυσιολογικά;

Μια ερευνητική ομάδα από την Ουγγαρία δημιούργησε ένα νέο τρισδιάστατο ανθρώπινο κυτταρικό μοντέλο του Συνδρόμου Kleefstra, χρησιμοποιώντας κύτταρα που προέρχονταν από άτομο με το σύνδρομο.

Η μελέτη με τίτλο Establishment of human pluripotent stem cell-derived cortical neurosphere model to study pathomechanisms and chemical toxicity in Kleefstra syndrome δημοσιεύθηκε στο Scientific Reports και περιγράφει τη δημιουργία και τον χαρακτηρισμό 3D cortical neurospheres, δηλαδή μικρών τρισδιάστατων δομών νευρικών κυττάρων που αναπτύσσονται στο εργαστήριο και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη της ανάπτυξης και της λειτουργίας του ανθρώπινου νευρικού συστήματος.

Το σημαντικότερο αποτέλεσμα της εργασίας δεν είναι ότι βρέθηκε κάποια θεραπεία.

Είναι ότι δημιουργήθηκε ένα ανθρώπινο εργαστηριακό μοντέλο του Kleefstra, το οποίο αναπαράγει αρκετά από τα κυτταρικά και μοριακά χαρακτηριστικά που έχουν συνδεθεί με την ανεπάρκεια του EHMT1 και μπορεί στο μέλλον να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση μηχανισμών της νόσου και για τον έλεγχο πιθανών φαρμακευτικών ουσιών.

Τι είναι τα iPSCs

Η μελέτη βασίστηκε σε μια τεχνολογία που έχει αλλάξει σημαντικά τον τρόπο με τον οποίο μελετώνται οι σπάνιες γενετικές παθήσεις.

Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν induced pluripotent stem cells, iPSCs, στα ελληνικά επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα.

Με απλά λόγια, λαμβάνονται κύτταρα από έναν άνθρωπο και, μέσω ειδικής εργαστηριακής διαδικασίας, «επαναπρογραμματίζονται» ώστε να αποκτήσουν ξανά την ικανότητα να εξελιχθούν σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

Στη συνέχεια μπορούν να κατευθυνθούν ώστε να μετατραπούν, για παράδειγμα, σε νευρικά κύτταρα.

Το μεγάλο πλεονέκτημα είναι ότι τα κύτταρα αυτά διατηρούν το γενετικό υπόβαθρο του ανθρώπου από τον οποίο προήλθαν.

Στην περίπτωση αυτής της μελέτης, η κυτταρική σειρά του Kleefstra προερχόταν από ένα κορίτσι 11 ετών με παθογόνο μεταβολή του EHMT1, η οποία οδηγούσε σε απώλεια λειτουργίας του γονιδίου. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν παράλληλα κύτταρα υγιούς ατόμου ως ομάδα ελέγχου.

Από ανθρώπινα κύτταρα σε τρισδιάστατες νευρόσφαιρες

Αρχικά, τα iPSCs μετατράπηκαν σε νευρικά προγονικά κύτταρα, δηλαδή κύτταρα που βρίσκονται σε ένα πρώιμο στάδιο και μπορούν να εξελιχθούν σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων του νευρικού συστήματος.

Στη συνέχεια οι ερευνητές τα καλλιέργησαν σε τρισδιάστατη μορφή ώστε να δημιουργηθούν cortical neurospheres, μικρές σφαιρικές δομές που αποτελούνται από νευρικά κύτταρα και έχουν χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τον εγκεφαλικό φλοιό.

Οι νευρόσφαιρες καλλιεργήθηκαν για 57 ημέρες, επιτρέποντας στους ερευνητές να παρακολουθήσουν την ανάπτυξή τους και να συγκρίνουν το μοντέλο Kleefstra με το μοντέλο ελέγχου.

Δεν πρόκειται για έναν πλήρη «μικροσκοπικό εγκέφαλο».

Οι νευρόσφαιρες είναι πολύ απλούστερες από τον ανθρώπινο εγκέφαλο και ακόμη και από τα πιο σύνθετα εγκεφαλικά organoids. Αυτή η σχετική απλότητα όμως αποτελεί και πλεονέκτημα, επειδή οι νευρόσφαιρες μπορούν να είναι περισσότερο ομοιογενείς και αναπαραγώγιμες, κάτι ιδιαίτερα χρήσιμο όταν θέλουμε στο μέλλον να συγκρίνουμε πολλές διαφορετικές ουσίες σε ένα σύστημα drug screening.

Διαφορετική ανάπτυξη των νευροσφαιρών του Kleefstra

Μία από τις πρώτες εμφανείς διαφορές αφορούσε τον τρόπο ανάπτυξης των τρισδιάστατων δομών.

Οι νευρόσφαιρες σχηματίστηκαν τόσο από τα κύτταρα του ατόμου με Kleefstra όσο και από τα κύτταρα ελέγχου.

Ωστόσο, ενώ οι νευρόσφαιρες της ομάδας ελέγχου συνέχιζαν να αυξάνονται σε μέγεθος κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, η ανάπτυξη των νευροσφαιρών του Kleefstra ήταν σημαντικά περιορισμένη.

Στο τέλος των 57 ημερών το μέγεθός τους παρέμενε περίπου στο επίπεδο από το οποίο είχε ξεκινήσει η τρισδιάστατη καλλιέργεια.

Οι ερευνητές εντόπισαν παράλληλα χαμηλότερη έκφραση του Ki67, ενός δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού, καθώς και μεταβολές σε άλλους δείκτες που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και προσκόλληση.

Επιβεβαίωσαν επίσης χαμηλότερα επίπεδα H3K9me2, μιας επιγενετικής τροποποίησης που φυσιολογικά σχετίζεται με τη δραστηριότητα του EHMT1.

Το εύρημα αυτό είναι σημαντικό επειδή δείχνει ότι το εργαστηριακό μοντέλο διατηρεί μια βασική βιολογική συνέπεια της ανεπάρκειας του EHMT1.

Περισσότερη ανάπτυξη νευριτών

Παρά την περιορισμένη ανάπτυξη των ίδιων των νευροσφαιρών, εμφανίστηκε ένα αποτέλεσμα που αρχικά μπορεί να μοιάζει αντιφατικό.

Όταν οι ερευνητές εξέτασαν την ανάπτυξη των νευριτών, δηλαδή των προεκτάσεων που δημιουργούν τα νευρικά κύτταρα και μέσω των οποίων σχηματίζονται σταδιακά οι νευρωνικές συνδέσεις, τα κύτταρα του Kleefstra παρουσίασαν μεγαλύτερη ανάπτυξη από εκείνα της ομάδας ελέγχου.

Παράλληλα εντοπίστηκε αυξημένη έκφραση του BDNF, ενός σημαντικού νευροτροφικού παράγοντα που συμμετέχει στην ανάπτυξη, επιβίωση και πλαστικότητα των νευρώνων.

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η επίδραση της ανεπάρκειας του EHMT1 στη νευροανάπτυξη δεν είναι απλώς μια γενικευμένη «μείωση» της ανάπτυξης.

Φαίνεται να μεταβάλλονται διαφορετικές διαδικασίες με διαφορετικό τρόπο.

Και αυτό ακριβώς είναι ένα από τα πλεονεκτήματα τέτοιων ανθρώπινων κυτταρικών μοντέλων. Επιτρέπουν στους ερευνητές να εξετάσουν ξεχωριστά αυτές τις διαδικασίες και να προσπαθήσουν να κατανοήσουν πώς συνδέονται μεταξύ τους.

Διαφορετική σύνθεση νευρωνικών πληθυσμών

Μία ακόμη σημαντική διαφορά αφορούσε τι είδους νευρώνες αναπτύχθηκαν μέσα στις νευρόσφαιρες.

Στο μοντέλο Kleefstra υπήρχε μεγαλύτερη παρουσία νευρώνων που εξέφραζαν VGLUT1/2, δείκτες που σχετίζονται με γλουταματεργικούς νευρώνες.

Αυξημένοι ήταν επίσης οι χολινεργικοί νευρώνες, οι οποίοι αναγνωρίστηκαν μέσω της έκφρασης ChAT.

Αντίθετα, οι TH-positive κατεχολαμινεργικοί νευρώνες ήταν σημαντικά λιγότεροι και σχεδόν απουσίαζαν από τις νευρόσφαιρες του Kleefstra σε σύγκριση με το μοντέλο ελέγχου.

Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια του EHMT1 μπορεί να επηρεάζει όχι μόνο την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων αλλά και τον τρόπο με τον οποίο διαφοροποιούνται προς συγκεκριμένους νευρωνικούς πληθυσμούς.

Το NMDAR1 εμφανίζεται ξανά

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ένα ακόμη εύρημα.

Οι ερευνητές βρήκαν αυξημένη έκφραση του NMDAR1 στις νευρόσφαιρες του Kleefstra.

Το NMDAR1 αποτελεί βασική υπομονάδα των υποδοχέων NMDA, οι οποίοι συμμετέχουν στη γλουταματεργική νευροδιαβίβαση και παίζουν σημαντικό ρόλο στη συναπτική πλαστικότητα, τη μάθηση και την ανάπτυξη των νευρωνικών δικτύων.

Το εύρημα αποκτά μεγαλύτερο ενδιαφέρον επειδή μεταβολές στη λειτουργία των NMDA υποδοχέων είχαν παρατηρηθεί και σε προηγούμενες εργαστηριακές μελέτες με νευρώνες που προέρχονταν από άτομα με Kleefstra.

Οι συγγραφείς θεωρούν επομένως ότι η αυξημένη έκφραση NMDAR1 μπορεί να αποτελεί ένα επαναλαμβανόμενο χαρακτηριστικό των ανθρώπινων νευρωνικών μοντέλων του Kleefstra.

Αυτό δεν σημαίνει ότι έχει ήδη αποδειχθεί πως το NMDAR1 αποτελεί θεραπευτικό στόχο στους ανθρώπους.

Δείχνει όμως έναν βιολογικό μηχανισμό που εμφανίζεται σε περισσότερα από ένα εργαστηριακά μοντέλα και επομένως αξίζει περαιτέρω διερεύνηση.

Γιατί οι ερευνητές εξέτασαν και την ευαισθησία σε χημικές ουσίες

Ένα δεύτερο σκέλος της μελέτης αφορούσε την πιθανότητα τα κύτταρα με ανεπάρκεια EHMT1 να αντιδρούν διαφορετικά σε εξωτερικές χημικές επιδράσεις.

Οι ερευνητές εξέθεσαν τόσο τα νευρικά προγονικά κύτταρα όσο και τις ώριμες νευρόσφαιρες σε τέσσερις διαφορετικές ουσίες:

paraquat, rotenone, bardoxolone και doxorubicin.

Στόχος δεν ήταν να εξεταστούν οι ουσίες αυτές ως θεραπείες για το Kleefstra.

Χρησιμοποιήθηκαν ως εργαστηριακά εργαλεία για να διερευνηθεί εάν ο γονότυπος και το στάδιο ανάπτυξης των νευρικών κυττάρων επηρεάζουν την ευαισθησία τους σε διαφορετικούς χημικούς παράγοντες.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ευαισθησία πράγματι εξαρτιόταν τόσο από την ουσία όσο και από το αναπτυξιακό στάδιο των κυττάρων.

Ιδιαίτερα οι ώριμες νευρόσφαιρες του Kleefstra παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στο paraquat.

Το εύρημα είναι ερευνητικά ενδιαφέρον, αλλά δεν πρέπει να μεταφραστεί σε κλινικό συμπέρασμα ότι τα άτομα με Kleefstra είναι γενικά περισσότερο ευαίσθητα σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές ουσίες.

Η μελέτη πραγματοποιήθηκε in vitro, σε καλλιεργημένα κύτταρα, και απαιτείται πολύ περισσότερη έρευνα πριν τέτοιες παρατηρήσεις αποκτήσουν οποιαδήποτε σημασία για την καθημερινή φροντίδα των ατόμων με το σύνδρομο.

Γιατί ένα τέτοιο 3D μοντέλο είναι σημαντικό

Για να αναπτυχθεί κάποτε μια στοχευμένη θεραπεία για μια γενετική νευροαναπτυξιακή διαταραχή, δεν αρκεί να γνωρίζουμε ποιο γονίδιο ευθύνεται.

Πρέπει να καταλάβουμε τι ακριβώς αλλάζει μέσα στα ανθρώπινα κύτταρα όταν το γονίδιο αυτό δεν λειτουργεί σωστά.

Στο Kleefstra γνωρίζουμε ότι η απώλεια λειτουργίας του EHMT1 μεταβάλλει την επιγενετική ρύθμιση πολλών άλλων γονιδίων.

Το επόμενο ερώτημα είναι πώς αυτή η αρχική γενετική μεταβολή οδηγεί στις αλλαγές που παρατηρούνται στην ανάπτυξη, τη λειτουργία των νευρώνων και τελικά στον φαινότυπο του συνδρόμου.

Τα ζωικά μοντέλα παραμένουν εξαιρετικά σημαντικά, αλλά δεν μπορούν να αναπαράγουν πλήρως την ανάπτυξη και τη λειτουργία του ανθρώπινου εγκεφάλου.

Από την άλλη πλευρά, οι παραδοσιακές καλλιέργειες κυττάρων σε επίπεδες επιφάνειες δεν μπορούν να αναπαράγουν τις τρισδιάστατες αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων που υπάρχουν μέσα σε έναν ιστό.

Τα patient-derived 3D models προσπαθούν να γεφυρώσουν αυτό το κενό.

Από τη μελέτη των μηχανισμών στο drug screening

Ίσως η μεγαλύτερη μελλοντική αξία του μοντέλου είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πλατφόρμα screening.

Αφού ένα εργαστηριακό μοντέλο εμφανίζει επαναλήψιμα χαρακτηριστικά του Kleefstra, οι ερευνητές μπορούν στο μέλλον να εξετάσουν εάν κάποια ουσία μπορεί να μεταβάλει αυτά τα χαρακτηριστικά.

Για παράδειγμα, θα μπορούσε να εξεταστεί εάν μια πειραματική παρέμβαση:

μειώνει ή επαναφέρει μια μη φυσιολογική μοριακή οδό,

βελτιώνει την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων,

επαναφέρει περισσότερο φυσιολογική νευρωνική διαφοροποίηση,

ή μεταβάλλει άλλους μετρήσιμους δείκτες που συνδέονται με την ανεπάρκεια του EHMT1.

Επειδή οι νευρόσφαιρες είναι σχετικά ομοιογενείς και μπορούν να παραχθούν σε μεγαλύτερο αριθμό, αποτελούν ένα σύστημα που μπορεί να είναι κατάλληλο για δοκιμή πολλών διαφορετικών υποψήφιων ενώσεων. Οι ίδιοι οι συγγραφείς αναφέρουν ως πιθανές εφαρμογές του μοντέλου την ανάπτυξη φαρμάκων και το screening προς περισσότερο εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές.

Δεν πρόκειται ακόμη για θεραπεία

Η συγκεκριμένη διάκριση είναι πολύ σημαντική.

Η μελέτη δεν δοκίμασε θεραπεία για το Σύνδρομο Kleefstra και δεν έδειξε ότι κάποια φαρμακευτική ουσία μπορεί να βελτιώσει τα χαρακτηριστικά του συνδρόμου σε ανθρώπους.

Το ουσιαστικό επίτευγμα είναι η δημιουργία του ίδιου του μοντέλου.

Πριν μπορέσουμε να αξιολογήσουμε συστηματικά εκατοντάδες ή χιλιάδες πιθανές ενώσεις, χρειαζόμαστε ένα αξιόπιστο εργαστηριακό σύστημα στο οποίο να μπορούμε να τις δοκιμάσουμε.

Η συγκεκριμένη εργασία αποτελεί ένα βήμα προς τη δημιουργία μιας τέτοιας υποδομής.

Ένας σημαντικός περιορισμός, το μοντέλο προέρχεται από ένα άτομο

Παρά τα ενδιαφέροντα αποτελέσματα, υπάρχει ένας πολύ σημαντικός περιορισμός.

Το μοντέλο Kleefstra δημιουργήθηκε από μία patient-derived iPSC κυτταρική σειρά, δηλαδή από ένα άτομο με συγκεκριμένη παθογόνο μεταβολή του EHMT1.

Το Σύνδρομο Kleefstra παρουσιάζει μεγάλη γενετική και κλινική ετερογένεια.

Διαφορετικοί άνθρωποι μπορεί να έχουν διαφορετικές sequence variants στο EHMT1 ή μεγαλύτερες διαγραφές της περιοχής 9q34, ενώ ακόμη και άτομα με παρόμοιες γενετικές μεταβολές μπορεί να παρουσιάζουν διαφορετικό φαινότυπο.

Επομένως, δεν γνωρίζουμε ακόμη σε ποιο βαθμό όλα τα χαρακτηριστικά που παρατηρήθηκαν σε αυτή την κυτταρική σειρά είναι κοινά σε ολόκληρο το φάσμα του Kleefstra.

Η δημιουργία αντίστοιχων 3D μοντέλων από περισσότερα άτομα με διαφορετικούς γονότυπους θα είναι ιδιαίτερα σημαντική για την επιβεβαίωση των ευρημάτων.

Από την περιγραφή του Kleefstra προς τη βιολογία του

Για πολλά χρόνια η έρευνα στο Σύνδρομο Kleefstra επικεντρωνόταν κυρίως στην αναγνώριση του γονιδίου, στην περιγραφή των κλινικών χαρακτηριστικών και στην καλύτερη κατανόηση του φαινοτύπου.

Αυτές οι μελέτες παραμένουν απαραίτητες.

Παράλληλα όμως αναπτύσσεται πλέον ένας διαφορετικός τύπος έρευνας.

Η δυνατότητα να δημιουργούνται ανθρώπινα νευρικά κύτταρα που φέρουν τη γενετική μεταβολή του Kleefstra και να οργανώνονται σε τρισδιάστατα συστήματα δίνει στους ερευνητές ένα νέο εργαλείο για να απαντήσουν σε αυτά τα ερωτήματα.